2-8℃ 避光

1.不可冻存！
2.冻存会失效！
3.拆封后请尽快使用完！

一年

荧光酶标仪 /荧光光度计 /激光共聚焦显微镜 /流式细胞仪

细胞

吞噬实验

1. 荧光酶标仪/荧光光度计/共聚焦显微镜/流式细胞仪
2. 超声清洗仪
3. 离心机
4. 移液器
5. 冰箱
6. 冰盒

1. PBS缓冲液或者HBSS
2.培养基

1. 离心管
2. 吸头
3. 一次性手套
4. 激光共聚焦皿 / 24 孔板（带爬片）

1. 预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。
2. 除了目标模型样本，须根据实验需要合理设置阳性对照、阴性对照、空白对照等样本。
3. 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体损失导致试剂量不够用。
4. 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。离心力在不损失细胞的前提下尽可能小，重悬细胞是动作要轻柔，避免多次反复的激烈吹打。不用涡旋振荡器。

电子版仅供参考，最终以试剂盒里的纸质说明书为准！


染色工作液的配制
1. 使用前将BBcellProbe® P23荧光探针试剂A母液涡旋振荡 30 s，然后在超声波清洗仪中使用30%功率超声处理10 min。
2. 根据样本数量，用37℃培养箱预热的无血清培养基将BBcellProbe® P23荧光探针100-200倍稀释。吸取超声后的母液，沿离心管壁缓慢加入无血清培养基中，轻轻颠倒混匀（禁止剧烈吹打，避免产生气泡）。稀释后在超声波清洗仪中使用20-30%功率超声处理5 min。配制成染色工作液。

吞噬检测：
1. 准备吞噬细胞：
获取待测的吞噬细胞（如从小鼠腹腔提取巨噬细胞，或从人外周血单核细胞诱导分化），接种于激光共聚焦皿 / 24 孔板（带爬片），铺板密度1×10^5~5×10^5 个 / 孔，无血清培养基同步化12~24 h。
2. 吸除细胞培养皿中的同步化培养基，加入稀释好的P23荧光工作液，每孔500 μL。
3. 共孵育：将细胞于染色工作液在37℃条件下共同孵育一段时间（通常为30分钟至4小时）。
4. 孵育结束后，快速吸除染色工作液，用预温至 37℃的检测缓冲液B洗细胞一次。
5. 用预热的无菌PBS轻柔洗涤细胞3~5 次。
6. 检测与分析。
用荧光显微镜/流式细胞仪检测。
共聚焦皿 / 爬片直接置于荧光显微镜 / 激光共聚焦显微镜下，选择对应荧光通道（FITC：488 nm 激发 / 520 nm 发射）。随机选取5~10 个视野拍照，统计吞噬阳性细胞率（含微球的细胞数 / 总细胞数 ×100%）.

用流式细胞仪检测细胞。吞噬了颗粒的细胞会携带荧光信号，通过设门分析，可计算出吞噬率等指标。洗涤后的细胞用 0.25% 胰酶（不含 EDTA） 轻柔消化，吹打为单细胞悬液，1000 r/min 离心 5 min，PBS 重悬，过 300 目筛网（避免细胞团块）。
流式细胞仪上样，设门圈定活细胞（FSC/SSC），检测对应荧光通道的荧光阳性细胞率（吞噬效率）和平均荧光强度（MFI）（反映单个细胞的吞噬量），以 4℃对照细胞为阴性门。

1. 对照如何设定？
建议设置以下对照：
4℃阴性对照：相同条件下 4℃孵育，排除微球非特异性吸附。
吞噬抑制剂对照：例如加入细胞松弛素 D（5~10 μmol/L），抑制肌动蛋白聚合，验证吞噬为能量依赖的主动内吞。
空白细胞对照：不加探针的细胞，排除细胞自发荧光。